Bactérias do gênero Azospirillum e sua relação com gramíneas

Geraldo Chavarria1 & Naiana de Mello2 1Eng.-Agr., Dr., Professor Fisiologia das Plantas Cultivadas, Universidade de Passo Fundo, Passo Fundo-RS.e-mail: geraldochavarria@upf.br (Autor para correspondência).2Mestranda em Agronomia, Universidade de Passo Fundo, Passo Fundo-RS. e-mail: naianamello@yahoo.com.br.

Introdução

O desenvolvimento de biotecnologias capazes de reduzirem o uso massivo de fertilizantes e agroquímicos, em busca de maior produção e qualidade, são estratégicas para substituição de paradigmas agrícolas tradicionais que se baseiam simplesmente na visão da lucratividade e na despreocupação com os reflexos ambientais da atividade agrícola.

O nitrogênio (N) é um dos elementos necessário em maior quantidade para funcionamento adequado das plantas, e faz parte de nucleosídeos de fosfato e aminoácidos, que compõe a estrutura dos ácidos nucléicos e das proteínas, respectivamente. É considerado um dos nutrientes mais importantes (DOBBELAERE & OKON, 2007).

O uso de fertilizante nitrogenado é uma prática comum e responsável por elevar os custos da produção agrícola, além de poder gerar danos ao ambiente, uma vez que parte do total aplicado é geralmente perdido. A eficiência de utilização dos fertilizantes nitrogenados é em média 50%, devido à ação da lixiviação, volatilização de amônia, desnitrificação, erosão e imobilização microbiana (REIS JUNIOR et al., 2010).

O N fornecido pelo processo de fixação biológica é menos propenso a lixiviação e volatilização já que ele é utilizado in situ, sendo assim, o processo biológico é uma alternativa barata, limpa e sustentável para o fornecimento de N na agricultura comercial (HUERGO, 2006).

A principal fonte de N na natureza é a atmosfera, que possui uma vasta quantidade (aproximadamente 78%) de N2 (TAIZ & ZEIGER, 2004). Porém, esta quantidade não está diretamente disponível aos seres vivos, precisando de fixação através de processo industrial ou natural (NUNES et al., 2003). No solo, o N encontra-se nas formas orgânicas (matéria orgânica e resíduos culturais), mineral (solução do solo e adsorvido a argilas) e gasosa (nos poros). As principais formas disponíveis são amônio (NH4+) e nitrato (NO3-). Este nutriente constitui um elemento extremamente limitante para a produtividade de gramíneas, como o trigo e o arroz, e principalmente, as de altas produções de grãos como o milho.

A reação de redução do N2 atmosférico à amônia requer uma energia de ativação bastante alta, não ocorrendo espontaneamente (QUADROS, 2009). Na indústria, o processo de fixação de N foi desenvolvido por Harber e Bosch, empregando-se como catalisador o ferro, temperaturas entre 300 a 500ºC e altas pressões (~3500 psig). Na natureza, alguns poucos microrganismos diazotróficos, ou fixadores de N tem a capacidade de reduzir o N2 atmosférico à amônia (DOBEREINER, 1990), podendo usar nitrogênio molecular (N2) da atmosfera como fonte nitrogenada através do que se chama fixação biológica de N (SILVA et al., 2004).

A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a conversão de N gasoso em outras espécies químicas nitrogenadas promovida por alguns organismos, que empregam o N fixado na biossíntese de proteínas e ácidos nucléicos (NUNES et al., 2003). A FBN representa a principal forma de fixar N2 atmosférico em amônio, revelando-se um ponto chave de ingresso do N molecular no ciclo biogeoquímico do nitrogênio (TAIZ & ZEIGER, 2004).

Existem rizobactérias que são consideradas promotoras do crescimento de plantas, devido a diversos benefícios que podem causar no metabolismo das plantas (BURDMAN et al., 2000). Dentre estes benefícios, existe a fixação de nitrogênio, bactérias fixadoras de N são encontradas na natureza na forma de vida livre ou em associação com plantas, e estão em geral amplamente distribuídas no solo (DIDONET et al., 2000). Sua utilização em práticas agrícolas está tornando-se relevante, visto que a adubação nitrogenada representa uma parcela importante dos custos de produção de culturas não-leguminosas.

Foi principalmente no início da década de sessenta que bactérias diazotróficas associadas à rizosfera foram isoladas pelo grupo de pesquisa da Dr. Johana Dobereiner (BALDANI et al., 1997). Os meios de cultura semisólidos foram importantes para o descobrimento de espécies de bactérias fixadoras de N2 que vivem em uma associação com raízes de gramíneas, pois estas são microaeróbicas quando dependente da FBN, somente fixam N2 quando não há acúmulo de oxigênio entorno delas (DOBEREINER, 1990).

Dentre estes microrganismos fixadores de N podem ser citados por associarem-se as raízes das plantas como o gênero Rhizobium, Frankia, Burkholderia, Azotobacter, Herbaspirillum, Acetobacter e Azospirillum.

Os benefícios obtidos pela inoculação destas bactérias, podem ser variados, e são descritos como diretos e indiretos. Dos quais, os primeiros são destacados o processo de fixação biológica de nitrogênio, produção de fitormônios (sobretudo auxinas) e solubilização de fosfato inorgânico. Os benefícios indiretos estão relacionados à indução sistêmica de resistência a doenças, controle biológico e produção de compostos orgânicos que captam ferro (sideróforos) (DOBBELAERE & OKON, 2007).

Características das rizobactérias do gênero Azospirillum

Discute-se que de 30 a 90% das amostras de solo coletadas no planeta contenham Azospirillum brasilense ou Azospirillum lipoferum. O potencial para uso na agricultura do gênero Azospirillum já foi bastante estudado, assim como, sua ecofisilogia (KEFALOGIANNI & AGGELIS, 2002). O gênero é representado por seis espécies diazotróficas, tendo as mais conhecidas A. brasilense e A. lipoferum.

O A. amazonense é encontrado em associação com milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, Brachiaria, palmeiras e frutíferas. O A. brasilense e o A. lipoferum já foram isoladas em diversos cereais, o A. halopraeferens foi isolada da gramínea Leptochloa fusca, o A. doebereinerae isolado de Miscanthus e o A. irakense isolada de arroz (OLIVEIRA et al., 2008).

Estas bactérias estão presentes em todos tipos de solos e possuem um diâmetro de um micrômetro (µm) e o comprimento de 2,1 a 3,8 µm (SILVA et al., 2004), são curvas, móveis e de variadas origens geográficas (HUERGO, 2006). A temperatura ótima de crescimento varia entre 28 e 41ºC, dependendo da espécie (ECKERT et al., 2001). São microrganismos aeróbicos típicos quando supridos com fonte de N combinado, e microaerofílicos quando crescem dependente da fixação de N2 (DONZELI, 2002).

Segundo DOBEREINER (1995) as fontes de carbono de maior preferência pelo Azospirillum são ácidos orgânicos como, o malato, piruvato, succinato, glicose e frutose. Segundo a autora, já as fontes de nitrogênio podem advir de amônia, aminoácidos, nitrato e nitrito e nitrogênio atmosférioco (N2). Todavia, são microrganismos capazes de crescer utilizando o N atmosférico como fonte única de nitrogênio (HUERGO, 2006). Algumas bactérias fixadoras de N2 ocorrem na superfície de raízes, no entanto espécies do gênero Azospirillum ocorrem no interior das raízes, entre os espaços intercelulares ou até dentro de algumas células da raiz, como no protoxilema, que pode ser completamente preenchido por estas (SIQUEIRA & FRANCO, 1988). As bactérias diazotróficas do gênero Azospirillum sp. tem a capacidade colonizar o sistema radicial, assim como, o colmo das gramíneas. O fator intrínseco à bactéria que determinará a maior mobilidade desta no solo e nas plantas será a presenças de flagelos (DE WEERT et al., 2002). Dentro das raízes, a bactéria fica protegida dos estresses do solo, como processos competitivos com outros organismos, acidez do solo, deficiência de P, entre outros (SIQUEIRA & FRANCO, 1988).

Em relação ao pH do solo, destaca-se a exceção do gênero Acetobacter que é capaz de crescer em meio extremamente ácido (pH abaixo de 3,0). Contudo, as demais bactérias fixadoras de N2 são pouco tolerantes a acidez, tanto no solo, como nos meios de cultura (SIQUEIRA & FRANCO, 1988).

Destaca-se que na nutrição mineral das bactérias os elementos mais limitantes são o nitrogênio, carbono e oxigênio. Altas concentrações de amônia (NH3+), e baixas concentrações de oxigênio e carbono, inibem o complexo nitrogenase do Azospirillum, reduzindo a sua população (KAVADIA et al. 2008).

Outra questão fundamental é a interação fenotípica, de modo que, dependendo da espécie de gramínea a qual a bactéria esteja associada, o Azospirillum apresenta uma maior ou menor atividade de fixação de N2, a exemplo do que ocorre na simbiose das leguminosas com rizóbio (SIQUEIRA & FRANCO, 1988).

Durante o ciclo vegetativo do milho e do sorgo a concentração de Azospirillum nas raízes e no solo é alta, ficando entre 106 e 107 células por grama de solo ou de raízes, este aumento também é verificado no interior das raízes e coincide com o pico de fixação de N2 (SIQUEIRA & FRANCO, 1988). Sendo considerado o mínimo para níveis adequados de fixação de nitrogênio, segundo DOBBELAERE & OKON (2007). Em trabalho realizado por MENDONÇA et al. (2006) com a avaliação do estabelecimento e colonização de estirpes de bactérias diazotróficas inoculadas em milho, observou-se que as bactérias se localizam mais frequentemente nas raízes, seguida pelos colmos e folhas.

Redução de adubação nitrogenada e rendimento em plantas inoculadas

O sistema de fixação de N2 pelo Azospirillum, assim como do Azotobacter, é predominantemente através de associação, onde a fonte de energia são os exsudatos das raízes das plantas hospedeiras, estimando-se que este tipo de fixação forneça um montante entre 40 a 200 kg de N ha-1 ano-1, de acordo com o genótipo do hospedeiro e estirpe da bactéria, como também fatores abióticos, como o pH do solo (MARSCHNER, 1995).

Buscando incremento de rendimentos de gramíneas, quando for efetuada a inoculação de bactérias nas sementes, deve-se levar em consideração que estas estão amplamente distribuídas nos solos. Portanto, a inoculação à base de bactérias do gênero Azospirillum deve competir satisfatoriamente com as bactérias diazotróficas nativas e com microflora do solo (DIDONET et al., 2000). A capacidade competitiva das bactérias diazotróficas com outras é alta somente quando as condições do solo são de baixa disponibilidade de N no ambiente (SILVA et al., 2007). Em um trabalho desenvolvido com Azospirillum brasilense (SILVA et al., 2004), o efeito vinculado ao crescimento das raízes de trigo e cevada somente foi observado em solo pobre em nutrientes.

Em trigo, a resposta de rendimento em relação à inoculação com Azospirillum pode ser em grande parte creditada ao fitormônios, principalmente a auxina (DIDONET, 1993), devido a sua reconhecida ação na expansão das células vegetais. Segundo o mesmo autor, a inoculação de sementes de trigo com bactérias do gênero Azospirillum promoveu o crescimento das raízes, avaliado através do comprimento, massa da matéria fresca e número de raízes. Estes resultados podem ser atribuídos as substâncias que interferem no crescimento como auxinas e outros compostos. Segundo DIDONET et al. (2000), mesmo não ocorrendo incremento em rendimento de grãos, de maneira em geral, têm ocorrido um melhor uso dos fertilizantes, decorrente do maior desenvolvimento radicial nos estádios iniciais de crescimento das plantas proporcionado pelas bactérias.

Em experimentos realizados, com a cultura do trigo, de 2002 a 2006 em 297 localidades na região dos Pampas argentinos (precipitação pluvial na faixa de 500-1000 mm anuais) observou-se um incremento no rendimento entre as médias dos locais estudados de 260 kg por hectare com utilização de inoculante líquido a base de Azospirillum brasilense. Os autores destacam que em 70% dos locais estudados apresentaram resultados de incremento da produção (DÍAZ-ZORITA et al., 2009). Os mesmos também enfatizam que houve uma correlação positiva entre os maiores rendimentos e maiores acúmulos de matéria seca na parte aérea e raízes, assim como, no número e peso hectolitro de grãos.

O uso mais eficiente do N disponível promovido pela inoculação em alguns trabalhos demonstrou um reflexo sobre o incremento do índice de colheita no trigo, proporcionando maior aproveitamento da biomassa em benefício dos grãos, resultando em maior massa de mil grãos (DIDONET et al., 2000).

Como a inoculação com bactérias pode modificar a morfologia do sistema radicial, incrementando, além do número de radicelas, o diâmetro das raízes laterais e adventícias, provavelmente devido à produção, pela bactéria, de substâncias promotoras do crescimento, como auxinas, giberelinas e citocininas, e não somente pela FBN (CAVALLET et al., 2000). Essa produção de fitormônios interfere no crescimento das plantas e pode alterar a morfologia das raízes de modo que possibilite maior volume de exploração do solo, e por consequencia, mais influxo de nutrientes. As alterações morfológicas proporciona a elongação da zona para formação de raízes, promovendo desta maneira um aumento total do tamanho da raiz e planta e um maior desenvolvimento (SILVA et al., 2004). Resultados obtidos por DIDONET (1993) demonstraram que as raízes de plantas de trigo inoculadas apresentaram uma taxa mais elevada de excreção de prótons, resultando na queda de pH da rizosfera, devido a este fato a absorção de cátions foi incrementada.

Diferentemente do rizóbio, não pode-se vincular o rendimento das gramíneas inoculadas com a Azospirillum com a presença de nódulos e atividade visível da nitrogenase en função da coloração interna rosada do nódulo. Segundo trabalho descrito por SILVA et al. (2004), com trigo e cevada, as plantas não apresentam nodulação, mas ocorre um aumento na superfície das raízes, observando-se diferença entre a densidade de raízes secundárias e surgimento das raízes principais. As raízes secundárias em plantas inoculadas apresentaram menor número, no entanto, maior superfície de contato.

O incremento do sistema radicial em plantas inoculadas também pode propiciar maior longevidade aos tecidos verdes, em consequência ocorre um maior período de atividade fotossintética, o que resulta em quantidades maiores de fotoassimilados para os grãos ou para a própria assimilação de N, em relação às plantas não inoculadas (DIDONET et al., 2000).

Em trabalho desenvolvido por SAIKIA et al. (2007), plantas inoculadas com Azospirillum apresentaram maior taxa de fotossíntese e maior condutância estomática, resultando em maior rendimento de grãos em comparação com plantas não inoculadas, assim como o teor de nutrientes nos grãos foi maior em plantas inoculadas.

DIDONET et al. (2000), em um experimento conduzido com trigo, concluiram que a inoculação proporciona uma translocação mais eficiente da biomassa das plantas para os grãos, produzindo grãos com maior massa e mais cheios.

Devido ao processo de fixação biológica de N ser altamente oneroso para as células bacterianas, a adubação com N mineral sobre as bactérias fixadoras pode causar inibição do processo, com N disponível na forma mineral o complexo nitrogenase não é sintetizado e elas passam a utilizar o N disponível (SILVA et al., 2007). Devido à presença da nitrato redutase, a fixação de N2 é prejudicada em altas concentrações de nitrato no solo ou na planta, o que desfavorece a complementação da fertilização nitrogenada com FBN (DOBEREINER, 1990).

Segundo DOBEREINER (1990), assim como nas leguminosas o efeito da inoculação de cereais com estas bactérias depende do estabelecimento destas sob condições de campo. Diferentes estirpes da bactéria Azospirillum comportam-se distintamente conforme sua adaptação às condições em que é mantida, apresentando melhor crescimento quando isoladas de uma mesma região e de uma mesma espécie daquela que será utilizada (DIDONET, 1993). Sendo assim, a ineficiência observada em alguns inoculantes comerciais se deve, sobretudo, a ideia de que um produto possa servir para uma gama de condições edafoclimáticas, o que não é verdadeiro.

As diferenças entre genótipos de gramíneas na obtenção de N2 pela fixação biológica, mostram um grande potencial para a sua melhor exploração através do melhoramento vegetal (DOBEREINER, 1990).

Dentre os fatores ambientais, principalmente o estresse hídrico, têm grande influência sobre a população de microrganismos diazotróficos do solo e sobre o processo de fixação biológica de N (REIS JUNIOR et al., 2004). Sendo que, como constatado pelo mesmo autor em Brachiaria a distribuição dos microrganismos fixadores de N2 sofrem influência de acordo com o período do ano.

A interação entre outras bactérias pode produzir um sinergismo nos efeitos benéficos a fisiologia das plantas. A literatura científica apresenta alguns trabalhos onde a inoculação de Azospirillum associado ao Rhizobium mostrou efeito significativo sobre o número de nódulos, maior fixação de nitrogênio (caracterizado pelo incremento da redução do acetileno), maior teor de N mineral e macro e micronutrientes de maneiras geral quando comparada a inoculação efetua somente com o Rhizobium (BURDMAN et al., 1998; RODELAS et al., 1999).

Trabalhos na cultura do milho no Brasil, com o híbrido AS 1575 e SHS 5050, segundo a autora, apresentaram indícios que a inoculação de Azospirillum associada a 50kg de N na base, apresentaram desempenhos equivalentes, aos observados sem inoculação e 130kg de N, em relação ao rendimento de grãos (QUADROS, 2009). Considerando este fato, o custo da inoculação comercial situa-se na faixa de R$ 11,00 o hectare, e se hipoteticamente houver um efeito da inoculação reduzindo o uso de 80 kg de N com custo de médio de R$ 32,00 o kg do N. Teremos uma redução de custos na faixa de R$ 21,00 por hectare, sem adicionar o ganho ambiental do processo, pela redução das perdas para mananciais ou atmosfera, dependendo da fonte de N.

Produção de compostos indólicos e relações com déficit hídrico

Sabe-se da produção de fitormônios por microrganismos, e estudos já foram efetuados em diversas situações. Destaca-se a descoberta do fitormônio giberelina em plantas de arroz pelo ataque de fungos e o estímulo da produção deste fitormônio e alongamento em excesso das plantas (TAIZ & ZEIGER, 2004). Em relação ao gênero Azospirillum há alguns estudos que demostram a biossíntese de fitormônios, sobretudo auxinas, e este aspecto fitoestimulante pode favorecer o crescimento e o desenvolvimento das plantas (MARTÍNEZ-MORALES et al., 2003). BOTTINI et al. (1989) cita também a produção de pequenas quantidades de giberelinas e citocininas pelas rizobactérias Azospirillum sp..

A literatura científica descreve a presença de três rotas produtras de compostos indólicos (auxinas), das quais duas são dependentes de triptofano, e uma é independente deste aminoácido (LAMBRECHT et al., 2000). RADWAN et al. (2004) estudando a produção de compostos indólicos na presença de triptofano e variações de fontes de N nas culturas do trigo e arroz, observaram que as estirpes de Azospirillum produziram de três a sete vezes mais compostos indólicos (entre 300 a 500 μM) que as de Herbaspirillum. No mesmo experimento também foi verificado que nas estirpes de Azospirillum, as fontes NH4Cl, (NH4)2SO7, NH4H2PO4 e NH4NO3 estimulam a produção de indóis em baixas concentrações e a adição das fontes KNO3, NaNO3, NaNO3, KNO2 inibe a produção de indóis nas bactérias e reduz a multiplicação de células de Azospirillum.

Sabe-se que o balanço entre auxinas e citocininas na planta como um todo determina o maior crescimento da raiz ou parte aérea. Quando o balanço pende para uma maior concentração de auxinas há uma indução ao crescimento radicial, ao passo que, uma maior concentração de citocininas favorece o crescimento da parte aérea (SPAEPEN et al., 2009). Deve ser destacado que o estímulo de biossíntese de auxinas nas raízes das plantas é de extrema relevância, pois este fitormônio se tratando de um composto que estimula a divisão e o crescimento celular, a área superficial de raízes pode aumentar, e consequentemente, a capacidade de absorção de água e nutrientes (Figura 1). Assim como, um incremento na tolerância ao déficit hídrico destas plantas inoculadas. Em testes com plântulas de milho foi observado uma promoção de raízes laterais e inibição da elongação das raízes, tendo a aplicação exógena de auxina, uma massa seca média de raízes de 0,0379g e com Azospirillum brasilense (UAP 154) 0,0658g (MARTÍNEZ-MORALES et al., 2003).

Figura 1. Detalhe de diferenças de área superficial de sistema radicial de planta não-inoculada (esquerda) e inoculada (direita) com Azospirillum brasilense. Foto: Mariangela Hungria (Embrapa Soja).

O problema da salinização de lavouras pode ser mitigado pela utilização de Azospirillum sp. em função de seus efeitos sobre a tolerância ao estresse hídrico. CREUS et al. (1998) observaram que plantas de trigo inoculadas sofreram menos os efeitos deletérios da salinidade quando inoculadas com Azospirillum brasilense Sp 245. Os autores enfatizam que os efeitos na tolerância a salinização não são obtidos em função de variação de potencial osmótico no interior das células, mas sim, pelo alongamento das raízes. Contudo, foi observado que o Azospirillum pode restringir o influxo de sódio para as raízes através da produção de exopolissacarídeos (ASHRAF et al., 2004).

Relação com produtos fitossanitários

As informações relativas aos efeitos de produtos fotossanitários utilizados na proteção de sementes e a suas relações com Azospirillum ainda são muito escassaz. Contudo, de maneira mais genérica, ou seja, levando em consideração também bactérias diazotróficas para leguminosas, diversos estudos demonstram o efeito deletério de inseticidas e fungicidas utilizados em sementes sobre microrganismos fixadores de nitrogênio (ARAÚJO & ARAÚJO, 2006). Porém, SANCHEZ et al. (1994) obserservaram que o Azospirillum brasilense pode tolerar altas concentrações do inseticida diflubenzuron, sem perder sua capacidade de fixação de N.

Em relação aos fungicidas, a literatura destaca resultados de toxidez dos princípios ativos captan e thiram, tanto sobre o crescimento da bactéria, quanto pela atividade de fiaxação de N (GALLORI et al., 1991). PEREYRA et al. (2008) observaram que a estirpe Sp 245 de Azospirillum brasilense inoculada no trigo estimulou o crescimento de raízes na cultura do trigo e não foi afetada pelo tratamento de sementes com tebuconazole concluindo que a utilização do fungicida é compatível com a inoculação da bactéria.

Havendo uma gama de moléculas fungicidas e inseticidas utilizadas para o tratamento de semente no mercado é importante que haja incessantemente um processo de avaliação dos efeitos desta moléculas sobre a biologia da bactérias no que tange a mobilidade, multiplicação, fixação simbiótica de nitrogênio e efeitos promotores do crescimento.

Conclusões

Embora a utilização agrícola de bactérias do gênero Azospirillum sp. não esteja consolidada no Brasil, levando em consideração os conhecimentos mais relevantes das bactérias do gênero e a sua interação com cereais, pode-se considerar um benefício a inoculação de sementes destas espécies. Tendo a literatura apontado diversos aspectos positivos, desde o mais importante que é a redução da adubação nitrogenada, e consequentemente, o custo de produção destas culturas.

Sabe-se que a inoculação destas bactérias em sementes de gramíneas pode interferir no crescimento e produtividade em função da fixação biológica de nitrogênio, produção de fitormônios, produção de sideróforos e solubilização de fósforo no solo. Dentre a melhor justificativa da inoculação destas bactérias em sementes de gramíneas está a possibilidade de redução da adubação nitrogenada. Contudo, outro aspecto importante é a indução ao maior crescimento radicial em função da produção de compostos indólicos (auxinas), citocinas, giberelinas e poliaminas. Estes podem conferir uma maior área superficial radicial, e consequentemente, maior absorção de água e nutrientes.

Todavia, mais estudos devem ser realizados buscando estirpes mais eficientes para as variadas condições edafoclimáticas brasileiras. Considerando-se que não é possível fazer generalização em relação quanto à bactéria, genótipo e condição edafoclimática.

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Publicado na Revista Plantio Direto 125, setembro/outubro de 2011.